Cas9也能用于嗜热菌基因组编辑,Cas9基因靶向修饰

在本研究中,作者利用spCas9成功在芽孢杆菌ET138(Bacillus smithii ET 138/ET 138)中运用,该菌生长温度较宽,可在37°到65°温度之间生长。

赵庆顺教授告诉您利用CRISPR技术需要注意哪些关键点

经过实验测得,spCas9在ET 138体内只有在37°的情况下才会作用,而当温度达到42°以上时,spCas9在ET 138体内是没有切割活性的,于是利用这一点作者形成了一个单质粒的CRISPR系统,该质粒上包括同源修复用的同源臂、spCas9,、sgRNA表达框,利用温度来控制spCas9的表达。基因组编辑工作首先在55度下进行,让菌液在55度条件下培养24小时,尔后每隔24小时用新鲜的培养基重新培养菌体,放置的温度从55°逐渐降到37°,然后又将温度逐渐从37°上升到55°。经过实验证明,该系统的效率为50%左右。

第十五期CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术南京学习班

为了提高效率和运行速度,研究者将从55°降温到37°过程的循环次数从原来的4次降到1次,在每个温度的培养时间减少到8到16小时。

2017年9月15-17日 周五-周日 14日报到

研究者利用这套系统,成功实现了ET 138的基因组中基因的敲除、敲入。该操作程序可在一个星期内完成基因敲除/敲入,其中包括质粒丢失的时间,该系统可实现100%基因敲除,90%基因删除,20%基因敲入。该系统适用于内源的修复系统较强且生长温度较宽。

参会学员免费获得一份CRISPR/Cas9三合一对照质粒

赵庆顺 教授

南京大学模式动物研究所 遗传学与发育生物学教授

2001-2003年在杜克大学医学中心进行博士后训练

2003年全职加入南京大学模式动物研究,2006年晋升为教授

往期学员评价

评价一:CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因定点编辑技术,越来越被研究者所关注。在赵庆顺教授理论结合实际、幽默接地气的授课方式下,为期两天半的培训轻松且充实,让我从对CRISPR/Cas9技术的毫无所知,到对该技术原理及应用有了的全面认识;同时,结合开展的实验环节,掌握了CRISPR序列的设计,基因组编辑工具的制备及向细胞内递送的方法;熟悉了利用CRISPR技术在动植物中敲入和敲除的过程;了解了CRISPR/Cas9脱靶问题解决方案。通过本次学习,受益匪浅!

评价二:有幸全程聆听赵教授的课,教授授课逻辑性非常强、条理清晰、讲解生动细致、内容丰富。教授知识面很广、知无不答言无不尽,绝对是个专业的研究学者。特别是对哪些技巧和注意哪些关键点讲的非常实用。比较适合从事动物植物细菌等微生物研究人员来学习。课程安排合理,由浅入深,适合不同人群,希望这个班能让更多的科研人员获益。

评价三:我是2016年在上海参加过赵教授的学习班,因我基础比较差,在实际应用过程中遇到了很多的问题,非常感谢南京尧顺禹生物科技有限公司工作人用耐心细致的课后服务。2017年2月主办单位上海玮瑜生物科技有限公司谢老师告知我老学员可以终身免费继续学习,我又去了一次南京。真是每一次都有不同的收获,感谢感谢再感谢,也祝玮瑜公司越办越好。

本期课程安排

第一天上午9:00-12:00

第一讲、基因组靶向修饰技术简介

1、基因组靶向修饰技术发展简史 2、基因组编辑技术的工作原理 3、第一代基因组编辑技术ZFN 4、第二代基因组编辑技术TALEN 5、第三代基因组编辑技术CRISPR/Cas9

第二讲、CRISPR的设计

1、CRISPR设计的依据及原则 2、常用CRISPR设计软件简介 3、CRISPR的在线设计演练 4、靶向编辑基因的基因型确认及CRISPR的再设计

第一天下午13:00-17:00

第三讲、CRISPR/Cas9基因组编辑工具的制备及向细胞内的递送策略

1、DNA形式的基因组编辑工具的制备与递送 2、RNA形式的基因组编辑工具制备及递送 3、RNP形式的基因编辑工具的制备与递送

实验一: CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建 CRISPR模板的制备

第四讲、sgRNA活性验证

1、体外法 2、体内法 2.1 插入缺失突变检测的基本策略 2.2 基于胚胎反应器的活性验证方法 2.3 基于细胞系的活性验证方法

实验二: CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建

CRISPR模板与线性化All-in-One载体的重组、 转化、 携带基因组编辑工具的转化子的培养

实验三:sgRNA活性体外验证 酶切反应的建立

第二天上午9:00-12:00

第五讲、利用CRISPR技术创建基因组编辑细胞系

1、基因敲入的供体设计原则及实例分析 2、基因组编辑工具导入细胞系的方法 3、基因组编辑细胞系的筛选及基因型的快速确认 4、敲入和/或敲除基因的功能确认策略

实验四:CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建 阳性转化子的快速验证法

实验五:基因组编辑突变体子的基因型鉴定 基因组DNA模板的快速制备、目标基因组DNA片段的PCR扩增

第二天下午13:00-17:00

第六讲、利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入动物突变体

1、RNA或RNP基因组编辑工具体细胞携带靶向突变等位基因的确认 3、基因组编辑突变体 5、基因敲除/敲入的功能确认策略

第七讲、利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入植物、真菌 和 细菌突变体

1、基因组编辑工具的制作 2、基因组编辑工具的递送 3、基因组编辑突变体 5、基因敲除/敲入的功能确认

实验六:CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建 电泳确认

实验七:sgRNA活性体外验证电泳观测sgRNA活性实验结果

实验八:基因组编辑子等位基因的基因型鉴定 电泳识别基因组编辑突变体

第三天上午9:00-12:00

第八讲、基因组编辑技术的脱靶问题

1、脱靶的产生原因 2、脱靶检测 3、解决脱靶问题的方法 4、脱靶问题对不同领域研究者的意义

第九讲、利用CRISPRi或CRISPRa技术调控基因在细胞中的表达

1、dCas9的特征简介 2、运用CRISPR技术调控基因在细胞中表达的基本实验过程 3、CRISPR技术的转录抑制 4、CRISPR技术的转录活化 5、碱基编辑技术简介

第十讲、CRISPR技术的伦理学问题

1、 新型基因组编辑技术的发展 2、基因组编辑技术的应用 3、基因组编辑技术的伦理学问题

上海玮瑜生物科技有限公司 上海服淡信息科技有限公司

2017年9月15-17日 南京市 江北新区 浦口经济开发区低碳谷

为了便于接送、统一指定南京龙华大酒店,住宿自理

标准间280元/人 合住140元/人 南京浦口区江浦街道龙华路2号近南京工业大学浦口校区

收费标准

3300元/人 授课期间发放纸质邀请函 按交费先后顺序确定名额及座位,注册费包含教材、午餐等费用。

账户名称:上海服淡信息科技有限公司 账 户 号:31578103002581719

开 户 行:上海银行桃浦支行

收款人:sci1976@126.com 支付宝户名:上海服淡信息科技有限公司

联系人:尹老师 13717838339 指定报名邮箱:yinhh@im.ac.cn

CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术

回 执 表

小写: 元(不包括住宿费

1我不要住宿 2 我要单人住 3我和我同事合住4我和其他学员合住 请将所选序号填写在()内

温馨提示:

1,为了能及时收到您的报名信息,请将此表填写完整后E-mail:yinhh@im.ac.cn并发送手机短信“姓名”到 13717838339 。谢谢

2,请您不要直接回复收到通知的邮箱,我们收到您的报名信息后及时给您回复,如果您超过2天没有收到回复请致电13717838339

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